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動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測(cè)方法
2012/4/20 [8429]

 

動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測(cè)方法
          —— ELISA & Charm
一、前言:
1、             現(xiàn)狀
目前獸醫(yī)用藥幾乎占據(jù)了所有抗微生物藥物的50%,因此食品病原菌、條件致病菌和共生菌不可避免的成了耐藥菌。在過去的50年中大約有100萬噸的抗生素被釋放到生物圈中。歐洲動(dòng)物衛(wèi)生聯(lián)盟(European Federation of Animal Health ,F(xiàn)EDESA)對(duì)歐盟和瑞士抗生素使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,僅1997年用于人類健康的抗生素達(dá)5460噸,用于動(dòng)物健康的抗生素達(dá)3465噸,用于動(dòng)物生長促進(jìn)劑的抗生素達(dá)1575噸,并有逐年增加的趨勢(shì)。
在我國,由于獸醫(yī)用藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使及相應(yīng)的檢測(cè)監(jiān)督體系不健全,藥物的濫用現(xiàn)象更為嚴(yán)重,動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥的污染時(shí)有發(fā)生。其潛在的致癌、致畸作用引起了社會(huì)的普遍關(guān)注,由于水產(chǎn)品中氯霉素含量過高,歐盟委員會(huì)于今年1月作出禁止中國動(dòng)物源食品進(jìn)口的協(xié)議,使得我國水產(chǎn)品對(duì)歐盟出口嚴(yán)重受挫,雖然現(xiàn)在部分產(chǎn)品開始解禁,但形式依然不容樂觀;美國、日本等國也開始高度關(guān)注我國水產(chǎn)品的質(zhì)量,并出臺(tái)一系列相關(guān)政策,對(duì)我國出口動(dòng)物性產(chǎn)品進(jìn)行限制。在現(xiàn)代文明的世界,健康*的貿(mào)易法則將是關(guān)稅、價(jià)格、質(zhì)量所不可比擬的,政治上的友好往來無法替代經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中的游戲規(guī)則。
2、食品中獸藥殘留對(duì)人類的危害
2.1耐藥菌株的產(chǎn)生
抗生素使用和細(xì)菌耐藥性永遠(yuǎn)是互相依存、互相制約的矛盾的兩個(gè)方面,細(xì)菌耐藥非正常增加,往往是抗生素的非正常使用的結(jié)果。早在1920-30年青霉素問世時(shí),Dr Fleming就提出了青霉素的耐藥性問題。隨著時(shí)代的發(fā)展和各種新藥的出現(xiàn),耐藥性菌株也接踵而至(即包括藥物選擇壓力的結(jié)果也包括細(xì)菌自身的進(jìn)化)。抗生素的副作用以及耐藥菌株的存在將嚴(yán)重威脅著人類的健康,而且臨床亞治療水平的抗生素更容易促使抗性基因的轉(zhuǎn)移,比如對(duì)動(dòng)物進(jìn)行低水平四環(huán)素治療,其糞腸菌群由對(duì)四環(huán)素敏感逐漸變成抗四環(huán)素zui后發(fā)展成對(duì)其它藥物也產(chǎn)生抗性。在長期的生活中,恰恰是人類和動(dòng)物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲(chǔ)存庫,并不斷的將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌,并在人和動(dòng)物中交叉?zhèn)鞑?,尤其是釋放到環(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴(yán)重,可造成耐藥基因的迅速轉(zhuǎn)移。
2.2抗生素的毒副作用
殘留在動(dòng)物性食品中的抗生素被人們食用后,除了加速人體內(nèi)耐藥菌株的進(jìn)化之外,抗生素本身的毒副作用往往威脅人類尤其是孕婦和嬰兒的健康,這一點(diǎn)在過去往往很容易被忽視。
2.2.1氯霉素
主要由Streptomyces venezuelae產(chǎn)生,目前已能人工合成。它能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生物合成,其效應(yīng)部位位于核糖體上,因而對(duì)大多數(shù)G+菌和G菌都有殺傷力。氯霉素的毒副作用較多,其常見的是再生障礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺和運(yùn)動(dòng)障礙及休克。雖然氯霉素在動(dòng)物疾病防治上曾發(fā)揮過一定的作用,但由于氯霉素可以產(chǎn)生致命性的副作用,因此歐盟已經(jīng)在畜牧、水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中禁止使用。
2.2.2b-內(nèi)酰胺
b-內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)肽酶的活性而干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成,安芐青霉素和青霉素G是該類zui常見的兩種化合物,由Penicillium chrysogenum產(chǎn)生。它可以通過胎盤傳給胎兒,也能通過乳腺進(jìn)入乳中。zui常見的副作用是以皮膚出現(xiàn)紅斑為主要癥狀的過敏反應(yīng)以及胃腸道紊亂引起的腹瀉、惡心和嘔吐。
2.2.3四環(huán)素
包括Oxytetracycline (土霉素,OTC)、tetracycline (四環(huán)素,TC)、 chlortetracycline (金霉素,CTC) doxycycline (強(qiáng)力霉素,DC)等。
2.2.4  b-興奮劑
        為擬交感神經(jīng)類藥物,該類興奮劑的受體為b2受體故得名。該類興奮劑可以促使肌肉骨骼肌血管壁擴(kuò)張、支氣管和子宮平滑肌松弛。因而在獸醫(yī)臨床上b2興奮劑被廣泛用作支氣管擴(kuò)張藥和子宮松弛藥,同時(shí)也被非法用作動(dòng)物營養(yǎng)再分配的促生長劑。副作用,如:焦躁、震顫、過敏、神智不清、食欲不振、惡心和嘔吐等以及心悸、高血壓、心律失常、心動(dòng)過速等心血管癥狀,其中擬交感神經(jīng)類物質(zhì)在組織中的溢出均可導(dǎo)致組織壞死。
2.2.5雌激素
是一種人工合成的非固醇類雌激素,主要用于治療婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤,為一種致癌物質(zhì);在肝臟中代謝緩慢,zui終能隨尿和糞便排出。副作用包括:水腫、引起性欲沖動(dòng)、改變?cè)陆?jīng)周期、乳房異常發(fā)育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、頭痛、皮膚紅斑、風(fēng)疹。對(duì)于雄性動(dòng)物來說,大劑量的雌激素可以增加血管栓塞的危險(xiǎn)。此外,雌激素還能引起子宮內(nèi)膜增生,使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌激素還可以導(dǎo)致骨骼發(fā)育閉合,停止生長。也能促使生殖道變形,對(duì)于雄性動(dòng)物能使精子變形以及嘔吐等。
2.2.6氨基甙類抗生素
主要包括慶大霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素等,為以氨基環(huán)醇和氨基糖相連成核糖單位的多價(jià)陽離子復(fù)合物。氨基甙類通過與細(xì)菌核糖體不可逆結(jié)合而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜塌陷。氨基甙類藥物的主要副作用是對(duì)聽覺器官和腎的毒性、過敏反應(yīng)以及對(duì)神經(jīng)肌肉的影響。其中,慶大霉素能引起肝功紊亂、外周和中樞神經(jīng)炎(包括腦炎、呆滯、抽搐);鏈霉素能導(dǎo)致神經(jīng)紊亂,包括視覺神經(jīng)炎和外周神經(jīng)炎,以及嚴(yán)重的皮炎、過敏等超敏感反應(yīng)。
二、獸藥殘留的快速檢測(cè)方法
目前上對(duì)抗生素和激素類藥物殘留的檢測(cè)主要有儀器分析法(包括HPLC和GC-MS)和生物學(xué)快速檢測(cè)法(如:ELISA、RIA、CharmⅡ等)。其中,儀器分析法既要求儀器設(shè)備具有相當(dāng)高的精度,也要求技術(shù)人員具有一定的操作和分析技能。作為儀器分析法,其昂貴的價(jià)格和軟件更新的緩慢以及操作上的煩瑣限制了此法的推廣;但由于檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到ng水平,在一些國家大型實(shí)驗(yàn)室里仍作為檢驗(yàn)的參考依據(jù)使用。生物學(xué)快速檢測(cè)法由于其操作上的簡便、快速以及達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn),以成為動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)的一種重要手段。尤其是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))和CharmⅡ,其操作上的簡便、快速和強(qiáng)烈的信噪比、達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn),其缺陷在于該法會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,但做為一種快速篩選方法備受技術(shù)人員的青睞,在檢測(cè)部門有著廣泛的應(yīng)用前景。
1、ELISA檢測(cè)
1.1 所需儀器設(shè)備
酶標(biāo)儀:常用的有美國的bio-lab(百樂),Bio-Tex,芬蘭Labsystem等,價(jià)格在5萬人民幣左右;
氮?dú)獯蹈蓛x:美國 Organomatic Associates,2萬左右;
洗板機(jī)(不一定要配置):與酶標(biāo)儀相應(yīng),價(jià)格在3-4萬人民幣左右;
離心機(jī):6000g/min,國產(chǎn)價(jià)格在5000左右;
均質(zhì)器:德國IKA,人民幣6000左右;(拍式均質(zhì)器:1-2萬)
移液器:單道:1550/件,多道:5000/件;
恒溫培養(yǎng)箱:
固相萃取儀:
1.2常用ELISA試劑盒
英國朗道(RANDOX),德國拜發(fā)(r-Biopharm),德國Riedel-deHaen,荷蘭E-D,美國NEOGEN,意大利Tecna等。
1.3檢測(cè)原理(競(jìng)爭法)
1.3.1 抗原抗體的基本結(jié)構(gòu)
1.3.2檢測(cè)的基礎(chǔ)是基于抗原抗體的膠體特性與極性基的吸附作用??贵w的蛋白質(zhì)(免疫球蛋白),大多數(shù)抗原也是蛋白質(zhì),在水溶液中都具膠體特性,并帶電荷,形成相對(duì)穩(wěn)定的親水膠體。同時(shí)抗原、抗體含有羧基、氨基及肽鏈等極性基團(tuán),當(dāng)兩者由于理化特性相吻合互相吸引而結(jié)合后,成為憎水膠體系統(tǒng)??乖涂贵w的相互吸引和結(jié)合是依靠下列各種分子間引力所促成:
庫侖吸引力/靜電引力,抗原和抗體分子相反電荷的氨基和羧基之間相互吸引而促成;
范德華引力,由于抗原和抗體分子的外層電子之間相互作用的擾動(dòng)產(chǎn)生一種引力,引起分子吸引而發(fā)生結(jié)合,這種作用取決于分子的空間構(gòu)型;
氫鍵結(jié)合作用,具-OH、-NH2、-COOH等親水基團(tuán)的抗體和相應(yīng)的抗原接近時(shí),可形成相對(duì)微弱和可逆的氫鍵橋梁,使得抗原抗體結(jié)合;
疏水作用,抗原抗體分子側(cè)鏈上的某些氨基酸(如亮氨酸、頡氨酸及苯丙氨酸等)為疏水基團(tuán),當(dāng)抗原抗體分子表面上的這些疏水基團(tuán)密切接觸時(shí)可排除水分子,在兩者之間產(chǎn)生相互吸引力而發(fā)生結(jié)合。
1.3.3抗原抗體的結(jié)合具有:
 特異性:取決于抗原決定簇的數(shù)量、性質(zhì)和立體構(gòu)型;抗體Fab段的高變區(qū)和相應(yīng)抗原決定簇的結(jié)合能力. 所以抗原抗體的種類質(zhì)量直接影響結(jié)果
 可逆行: 結(jié)合僅是分子表面的結(jié)合,而非共價(jià)鍵的結(jié)合,具有相對(duì)穩(wěn)定性但為可逆反應(yīng).一定條件下(低PH、冬融、高濃度鹽等)所以緩沖液很重要
zui適比例性:兩者量需具一定的量比關(guān)系才發(fā)生zui強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。所以抗原抗體的數(shù)量也是重要因素
反應(yīng)具階段性:受環(huán)境中電解質(zhì)、溫度、PH、等因素的影響。所以在ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)各種步驟一定要準(zhǔn)確到位。
1.3.4以氯霉素為例:
酶標(biāo)板包被針對(duì)兔IgG(氯霉素抗體)的羊抗體。加入氯霉素抗體,氯霉素酶標(biāo)記物,氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液。游離氯霉素與氯霉素酶標(biāo)記物競(jìng)爭氯霉素抗體結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)氯霉素抗體也與固定的羊抗體結(jié)合。沒有結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)和發(fā)色劑加到板孔中并孵育。結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。加終止液后使顏色由藍(lán)變黃。用450nm判讀,吸光度值與樣品中氯霉素含量成反比。 大多數(shù)試劑盒包被的是二抗。
RONDOX的試劑盒是直接將氯霉素特異性抗體預(yù)包被酶標(biāo)板上,當(dāng)在酶標(biāo)孔中加入樣品和酶標(biāo)記氯霉素后,樣品中的氯霉素和酶標(biāo)記氯霉素競(jìng)爭抗體結(jié)合位點(diǎn),洗滌后底物顯色,加酸終止之后,顏色由藍(lán)變黃。用450nm判讀,顏色深度與樣品中氯霉素含量成反比。
  不同的ELISA原理直接影響其檢測(cè)下限、特異性及結(jié)果的計(jì)算。
1.4 樣品的前處理
不同樣品有其特定的前處理方法,主要有以下幾種:
1.4.1有機(jī)物抽提法:(氯霉素)
利用藥物在有機(jī)物中的溶解性,達(dá)到分離純化的目的
樣品均質(zhì)         稱量      乙晴和或乙酸乙酯抽提       離心      吹干
      異辛烷/氯仿或正己烷抽提     離心      取水相分析
1.4.2離子交換法(如:C18過柱法)(鏈霉素)
離子交換是利用一些帶離子基團(tuán)的物質(zhì),吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)按所帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。
樣品稱量      溶解     上柱
C18柱平衡                 洗柱      吸柱干燥     洗提      吹干
緩沖液重懸      分析
1.4.3(免疫)親和層析(雌激素)
   利用生物大分子的生物學(xué)特性而設(shè)計(jì)的層析分離技術(shù),如利用抗原和抗體、酶和酶的抑制物或配體、激素和受體等之間的親和力,在一定條件下,兩者可緊密結(jié)合形成復(fù)合物,若將其中一者固定在載體上,則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方,并達(dá)到很高的純度?,F(xiàn)有商品化生產(chǎn),(方便,減少裝柱等繁瑣步驟)其操作步驟與上者相似,可以按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。
1.5酶標(biāo)免疫分析程序(室溫20-240C條件下操作)
每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量(包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定孔),以E-D CAP檢測(cè)試劑盒為例:
1)取出試劑盒恢復(fù)至室溫,充分混均;
2)釋緩沖液(以ddw)稀釋備用(也可用磷酸鹽緩沖液,但要);
3)洗緩沖液(以ddw)稀釋備用,也可用PBST(磷酸鹽土溫—20緩沖液);
4)酶標(biāo)記物的配制:按試劑盒說明配置、混均,2-8度陰暗處保存;
5)抗體的配制:按試劑盒說明配置、混均,2-8度陰暗處保存;
6)取足夠的微空條,記錄加樣順序;
7)a.吸取100微升稀釋緩沖液A1、A2(試劑空白),
b.吸取50微升稀釋緩沖液到B1B2(零標(biāo)準(zhǔn)),
c.吸取50微升標(biāo)準(zhǔn)液到CH孔,
d.加50微升樣品到其余孔;
8)加酶標(biāo)記物和抗體到除A1A2的所有孔;
10)蓋膜,震蕩1分鐘;
11)在一定條件下孵育;
12)洗板,一定要*充分,并且次數(shù)固定,推薦用洗板機(jī)(百樂);
13)加底物,室溫培養(yǎng)(25度)孵育;
14)加終止液;
15450nm波長下讀數(shù)。
1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
a.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液或樣品的OD值均要減去空白A1、A2OD值,
b.標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的OD值除以零標(biāo)準(zhǔn)(B1、B2)的OD
c. 繪制半對(duì)數(shù)曲線(以B/B0Y軸,標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù)為X軸),可用一些專業(yè)軟件,也可用半對(duì)數(shù)紙或在EXCEL上繪制。
2、Charm檢測(cè)
CHARM II 6600/7600分析儀是一臺(tái)多功能、單樣品的液體閃爍(LSC)和生物發(fā)光計(jì)數(shù)器。該法具有快速、簡便的特點(diǎn),但其假陽性率教高,適宜快速篩選
2.1儀器組成:
   Charm II 6600 / 7600分析儀
   Charm孵育器
   CentraCL2離心機(jī)
   均質(zhì)器、移液器
2.2 檢測(cè)原理
   微生物受體免疫分析法,屬于免疫分析法的一種,其建立的基礎(chǔ)是藥物功能團(tuán)與微生物受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)。在某些方面類似于放射免疫分析(RIA),所不同的是RIA使用抗體作為結(jié)合劑,而受體分析則是使用細(xì)菌細(xì)胞的固定位點(diǎn)當(dāng)做特殊的結(jié)合劑。
    一個(gè)單一的細(xì)菌細(xì)胞含有可結(jié)合藥物的特殊結(jié)合位點(diǎn),藥物和受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)離解常數(shù)低,因而具特異性和靈敏性。對(duì)于該法具體原理Charm公司未有詳細(xì)深入的報(bào)道(商業(yè)方面考慮),主要是利用兩種不同的細(xì)菌提供7大類抗生素結(jié)合的必須位點(diǎn),藥物的功能團(tuán)與位點(diǎn)有關(guān),不象免疫分析只涉及到側(cè)鏈,一種微生物受體可結(jié)合一類藥物的所有藥物。
象ELISA類似,這種結(jié)合也是一種競(jìng)爭結(jié)合。在試管中加入一定量的細(xì)菌(受體)、放射性標(biāo)記藥物和樣品,樣品中的藥物和放射性標(biāo)記藥物競(jìng)爭結(jié)合受體,未于受體位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記性藥物在讀數(shù)前被去掉,加入閃爍液,在分析儀上讀數(shù)。
2.3檢測(cè)的一般程序
2.3.1準(zhǔn)備工作:首先按說明書配制好所需的提取緩沖液、M2緩沖液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。
儀器零點(diǎn)測(cè)定:用空試管測(cè)定儀器的零點(diǎn)是否正常。
試劑和儀器有效性確認(rèn):檢測(cè)陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照液各3次,求出cpm值的平均值,與出廠的計(jì)數(shù)單對(duì)比,能在其±10%左右波動(dòng)。如果與計(jì)數(shù)單相比偏移較大,試劑可能部分失效,但只要陽性平均值/陰性平均值小于0.7,試劑仍然可用,但靈敏度會(huì)有所降低。
控制點(diǎn)的確定:控制點(diǎn)是陰性結(jié)果與陽性結(jié)果的臨界值。利用控制點(diǎn)來判斷結(jié)果。有兩種確定控制點(diǎn)的方法:根據(jù)樣品的種類或檢測(cè)水平選擇適當(dāng)?shù)目刂泣c(diǎn)確定方法??刂泣c(diǎn)確定方法有二。有些說明書上兩種方法都列出,用戶可根據(jù)需要選擇,選第二種。
方法一:直接以陰性對(duì)照來確定控制點(diǎn),一般樣品干擾小或接近儀器的下*,采用這種方法,只需再做3次,與前3次試劑性能確認(rèn)的結(jié)果一起求平均值,然后減法X%,即為控制點(diǎn)。X為變數(shù),由廠家用定量方法校準(zhǔn)。
方法二:以空白加標(biāo)樣品來確定控制點(diǎn)。這種方法的關(guān)鍵是找到陰性樣品,如果沒有其它的定量方法找陰性樣品,可根據(jù)陰性對(duì)照平均值來找陰性樣品(陰性對(duì)照平均值±X%)。用此陰性樣品,按檢測(cè)水平和稀釋倍數(shù),加抗生素標(biāo)準(zhǔn)品,用此空白加標(biāo)樣品,測(cè)定6CPM值,求平均值,控制點(diǎn)=平均值*(120%)。
2.3.2測(cè)定實(shí)際樣品
前處理:不同的樣品具不同的前處理方法,一般尿樣、血清、血漿等只需用緩沖液稀釋即可,而組織樣品則需均質(zhì)、提取、孵育等過程,對(duì)于蜂蜜等一些樣品則要過柱??偟膩碚f,前處理要比ELISA更簡便、快速。
按照操作說明檢測(cè)結(jié)合試劑片加入試管;加入300微升水混均;加入處理過的樣品;加入標(biāo)記性藥物,混合;孵育;離心,棄去上清液;加水混均;加閃爍液,混均;讀數(shù)。
三、實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制
涉及儀器的校正、過程控制、標(biāo)準(zhǔn)物控制、環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室管理(監(jiān)控所進(jìn)行的測(cè)試及記錄結(jié)果,以便發(fā)現(xiàn)發(fā)展趨勢(shì),統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行結(jié)果評(píng)審)
1、快速篩選方法及定性方法
選擇性:檢出目的物質(zhì)的能力;
靈敏性:樣品中檢出這種藥物真正陽性結(jié)果的比率;
準(zhǔn)確性:所得值和真實(shí)值的一致性,用不確定度來衡量——重復(fù)多次測(cè)定值和真實(shí)值之差;
檢測(cè)限:分析方法能從樣品背景信號(hào)中檢測(cè)出待檢物質(zhì)的zui低濃度;
重復(fù)性:
2、定量方法的附加要求
回收率:
定量限:分析方法能對(duì)樣品中待檢物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)的zui低濃度,反映該方法在低濃度端分析結(jié)果的可靠性;
精密度:對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定,每次測(cè)定值和均值的接近程度,主要反映隨機(jī)誤差;
重復(fù)性:批內(nèi)重復(fù)、批間重復(fù)線形范圍:曲線的擬和
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