液相色譜儀分析寡糖鏈結(jié)構(gòu)成分
2014-08-15
[2103]
1 試劑與儀器
Agilent 1100液相色譜儀；DMX 500核磁共振儀；正相 柱：Nucleosil 100 Silica 5 ，250 lnln×4．6 mm；氨基柱：Hypersil APS-1 250 mill× 4．6 mill，5 m；反相柱：Zorbax ODS 150 lnln×4．6 lnln，5， Sephadex LH-20葡聚糖凝膠；硅膠薄層板、薄層層析顯色劑、DMF、甲基甘露糖、甲基葡 萄糖、甲基半乳糖、Sepharose；(+)-MNB甲酸及(4-)-MNB甲酸由本實(shí)驗(yàn)室方法合成；HPLC所用試劑為國產(chǎn) HPLC級，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。葡聚三糖、葡聚六糖由。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2．1 寡糖的熒光衍生化反應(yīng) 取寡糖0．1 mg，按文獻(xiàn)[8]報(bào)道方法將其還原末端還原成糖醇，減壓濃縮至干。生成物溶于0．5 mL干燥的DMSO，加入0．1 mL新配制飽和NaOH水溶液，攪拌20 rain后加入0．2 mL CH I[9】反應(yīng)2 h，常溫減壓蒸餾除去 CH3I，LH-20柱分離純化(柱高 15 cm，內(nèi)徑0．8 cm，移動(dòng)相為，甲醇，流速為0．5 mL／min)。產(chǎn)物濃縮至干，加甲苯共沸除去水分，加入AcC1 5O0 和12 moVL的HC1 50密閉試管中50~C反應(yīng) 1 h。反應(yīng)結(jié)束后 ，反應(yīng)液經(jīng) N：吹干后，用 100 乙酸乙脂溶解，平均分成兩，管，再次用N：吹干，分別加人含有2 mg(+)及(±)-MNB甲酸的DMF溶液5o ，60~C反應(yīng)0．5 h。
2．2 I-IPLC分析 將2．2．I得到的寡糖熒光衍生物用HPLC移動(dòng)相稀釋后，用于 HPLC分析。
2．3 寡糖 ItPLC分析標(biāo)準(zhǔn)單糖(+)-MNB甲酸衍生物的合成
3 結(jié)果與討論
色譜條件的選擇 為有效分離各種單糖衍生物，本研究比較了硅膠柱、氨基柱和 ODS 3種層析柱的分離效果。在 ODS柱上，各樣品保留時(shí)間極為接近，分離效果不好。硅膠柱及氨基柱基本能達(dá)到分離目的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在氨基柱上5種單糖的D一，￡一手性對映體能有效分離，保留時(shí)間也相對較短；而在硅膠柱上，雖 然部分單糖樣品的分離因子及分離度優(yōu)于氨基柱，但是4-0．乙?；?，3，6．三．0．甲基葡萄糖 D．手性 異構(gòu)體的甲酸衍生物不能分開，改變移動(dòng)相配比，溫度條件等方法也未能達(dá)到分離目的。因此，zui終選擇氨基柱。
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